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文章發(fā)表 | 腫瘤患者HLA分型，“裕”加精準(zhǔn)！
2020-07-16
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期刊：Briefings in Bioinformatics，IF：8.999

“人類白細(xì)胞抗原”（HLA）基因可以編碼“人類主要組織相容性復(fù)合體”（MHC）蛋白，它們是人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分。精準(zhǔn)的HLA基因分型，能幫助預(yù)測(cè)患者ICI治療的療效，且是腫瘤新生抗原預(yù)測(cè)、腫瘤疫苗制備的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

為此，裕策生物評(píng)估了不同工具對(duì)NGS數(shù)據(jù)的HLA分型性能，開發(fā)了補(bǔ)丁讓HLA分型工具運(yùn)行更穩(wěn)定，基于打分算法整合多個(gè)分型結(jié)果，最終得到基于NGS數(shù)據(jù)獲取更準(zhǔn)確HLA分型的方案，以幫助腫瘤患者獲得更佳的治療方案和治療療效。

背景知識(shí)

HLA主要分兩類：HLA-I類基因編碼MHC I類蛋白，它們存在于除紅細(xì)胞外的所有細(xì)胞內(nèi)，專注于識(shí)別細(xì)胞內(nèi)因?yàn)椴《厩秩尽⒒蜃儺惖仍蚨a(chǎn)生的抗原，并將抗原轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面。

當(dāng)毒性T細(xì)胞與產(chǎn)生了抗原的細(xì)胞接觸時(shí)，會(huì)識(shí)別到抗原并清除該細(xì)胞（見下圖）；HLA-II類基因編碼MHC 2類蛋白，它們存在于抗原呈遞細(xì)胞中并且能識(shí)別細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的抗原，最終通過CD4+輔助T細(xì)胞刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體。

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HLA與腫瘤免疫治療

腫瘤細(xì)胞是一種特別狡猾的變異細(xì)胞，雖然他們會(huì)產(chǎn)生與普通細(xì)胞完全不同的腫瘤特異性抗原（新生抗原），但是它們很會(huì)隱藏和保護(hù)自己，例如通過讓HLA基因發(fā)生雜合性缺失（LOH）、下調(diào)HLA基因表達(dá)來減少被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面的抗原；分泌抗程序性死亡分子1的配體（PD-L1）來阻止被毒性T細(xì)胞消滅；阻礙免疫細(xì)胞浸潤(rùn)到腫瘤內(nèi)等方式。

隨著腫瘤免疫治療取得了越來越多的突破，現(xiàn)已成為最廣泛使用的泛癌種治療方法之一，越來越多的患者受益于免疫治療。最近的研究表明，HLA-I基因型（如HLA-B44和HLA-B62）和雜合性（LOH）狀態(tài)的缺失與患者的預(yù)后和免疫治療的療效相關(guān)。在腫瘤疫苗的應(yīng)用中，HLA的分型直接影響到新生抗原的預(yù)測(cè)，從而影響疫苗的制備。因此，HLA的準(zhǔn)確分型對(duì)于免疫治療意義重大。但是，HLA的多態(tài)性高的特點(diǎn)，使得精準(zhǔn)分型成為挑戰(zhàn)。

現(xiàn)有分型方法的局限

基于血清學(xué)和PCR的方法是當(dāng)前HLA分型的主流方法，這些方法具有速度慢、分辨率低、無法識(shí)別稀有的HLA亞型或成本高等缺點(diǎn)。

隨著NGS技術(shù)的發(fā)展，基于NGS技術(shù)的腫瘤基因組檢測(cè)在臨床和科研中得到廣泛應(yīng)用及NGS數(shù)據(jù)的HLA分型技術(shù)亦發(fā)展迅速，裕策生物的腫瘤檢測(cè)產(chǎn)品可以基于NGS數(shù)據(jù)一站式檢測(cè)患者的腫瘤基因組和HLA分型，減少了額外的HLA檢測(cè)步驟、降低成本、減少腫瘤患者寶貴的等待時(shí)間，幫助腫瘤患者獲得更佳的治療方案和治療療效。

閑話少敘，接下來看看我們?yōu)樘岣逪LA分型準(zhǔn)確性做了什么吧。

（以下內(nèi)容專業(yè)術(shù)語過多，看暈了的朋友可以直接滑到結(jié)尾點(diǎn)贊 (⊙?⊙)。）

研究?jī)?nèi)容

我們將患者的腫瘤組織和對(duì)照血分別進(jìn)行全外顯子組測(cè)序（WES），同時(shí)對(duì)患者的腫瘤樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq），并用PCR-SBT方法驗(yàn)證患者的HLA-I分型結(jié)果。使用OptyType、Phlat、Polysolver、seq2hla這四個(gè)廣泛使用的工具分別進(jìn)行HLA-I分型。將分型結(jié)果與驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行比較，計(jì)算出各工具的分型準(zhǔn)確性。 
注：HLA-I包含HLA-Ia,HLA-Ib兩類基因，目前針對(duì)HLA-Ia（HLA-A，-B，-C）基因的研究較多，針對(duì)HLA-Ib（HLA-E，-F，-G）基因的研究還比較少。本文針對(duì)HLA-Ia基因進(jìn)行分型性能評(píng)估，后面的HLA-I都是指HLA-Ia基因。

如下圖所示，基于WES和RNA-seq數(shù)據(jù)的HLA-I分型，準(zhǔn)確性最高的工具都是OptiType。并且基于WES數(shù)據(jù)的HLA-I分型的準(zhǔn)確性高于基于RNA-seq數(shù)據(jù)。

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圖1. 使用四個(gè)工具對(duì)WES,RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行HLA分型的準(zhǔn)確率

如下圖所示，我們對(duì)比三個(gè)工具的HLA-I分型準(zhǔn)確性，發(fā)現(xiàn)對(duì)照樣本都高于腫瘤組織，其中分型準(zhǔn)確性最高的工具仍是OptiType。

為了再次驗(yàn)證這個(gè)結(jié)果，我們用內(nèi)部開發(fā)工具對(duì)選取的樣本進(jìn)行測(cè)序數(shù)據(jù)隨機(jī)梯度抽取reads，模擬不同測(cè)序量的腫瘤和對(duì)照樣本，然后用OptiType分別進(jìn)行HLA-I分型，并統(tǒng)計(jì)模擬樣本的HLA-I分型準(zhǔn)確性。如圖2.b所示，隨著reads數(shù)量減少，模擬腫瘤樣本和模擬對(duì)照樣本的分型準(zhǔn)確性逐漸下降，且對(duì)照樣本的分型準(zhǔn)確性一直高于腫瘤樣本。

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圖2.a 使用三個(gè)工具對(duì)腫瘤和對(duì)照樣本進(jìn)行HLA-I分型的準(zhǔn)確率
b.梯度模擬樣本的HLA-I分型準(zhǔn)確率

很多情況下只有腫瘤組織被用于腫瘤基因組檢測(cè)，為了確保這種情況的HLA-I分型準(zhǔn)確性，我們統(tǒng)計(jì)了外顯子平均深度與HLA基因平均深度與HLA分型準(zhǔn)確性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)HLA基因區(qū)域平均深度>20x時(shí)，基于OptiType得到的HLA分型準(zhǔn)確性高（100%），而分型準(zhǔn)確性與外顯子平均深度無明顯相關(guān)性。這可能是測(cè)序存在的隨機(jī)性，導(dǎo)致外顯子平均深度很高時(shí)，部分樣本的HLA基因測(cè)序深度不高。
我們也做了一些原創(chuàng)性工作，在測(cè)試時(shí)發(fā)現(xiàn)OptiType有時(shí)會(huì)運(yùn)行錯(cuò)誤，便開發(fā)了一個(gè)補(bǔ)丁來解決這個(gè)問題，讓OptiType能夠穩(wěn)定運(yùn)行得到分型結(jié)果。另外，我們還基于打分策略開發(fā)了一個(gè)工具，整合腫瘤和對(duì)照樣本的多個(gè)分型工具的分型結(jié)果，讓分型準(zhǔn)確性達(dá)到99.9%，這個(gè)工具的性能我們還在持續(xù)驗(yàn)證中。
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結(jié)論

想必大家看這么久都困了，來看看我們的主要結(jié)論吧：

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我們的努力不僅如此，我們開發(fā)了補(bǔ)丁和整合工具，進(jìn)一步提升裕策產(chǎn)品中的HLA分型準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。此外，裕策生物的大panel腫瘤基因檢測(cè)產(chǎn)品還對(duì)HLA基因區(qū)域的捕獲進(jìn)行了優(yōu)化，進(jìn)而提升腫瘤患者的HLA雜合性缺失（LOH）檢測(cè)和優(yōu)質(zhì)新生抗原預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。

參考文獻(xiàn)：

Yi et al., Investigations of sequencing data and sample type on HLA class Ia typing with different computational tools, Briefings in Bioinformatics, 2020, 7


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