1、產品介紹
細胞是生物活動的基本功能單位，也是生命科學的核心研究對象。生物機體的組織由多種類型的細胞組成，每種細胞類型都有不同的譜系和獨特的功能，對組織和器官生物學產生影響，并最終定義機體整體的生物學功能。每個細胞的譜系和發(fā)育階段決定細胞如何對其他細胞和微環(huán)境產生應答。此外，由于隨時間產生的隨機變化，同類型細胞的亞群之間以及它們與其他細胞類型之間通常具有遺傳異質性。若想通過分析大量組織或細胞來深入了解機體的這種復雜性是很困難的，這就突顯出分離單細胞進行研究的必要性。
單細胞轉錄組測序指的是在單個細胞水平上研究基因表達的一項技術，其主要技術原理是每個分離得到的單細胞內包含的微量 mRNA 通過高效擴增后再進行測序，因此單細胞轉錄組測序可以有效解決細胞異質性問題，有助于細分細胞亞群并發(fā)現(xiàn)新的細胞類型，了解細胞發(fā)育和分化的調控機制等。
真正單細胞測序：10x genomics 技術原理類似于 Drop-seq，平臺利用微流體“雙十字”交叉系統(tǒng)分選單個細胞，通過 barcode 磁珠-單細胞-油滴的對應關系形成 GEM（Gel Beads-in emulsion），實現(xiàn)真正意義上的單細胞測序。
2、應用領域
1. 組織器官大規(guī)模細胞圖譜構建；
2. 細胞分型細化 & 稀有細胞類型鑒定；
3. 腫瘤方向研究 ：a) 腫瘤細胞異質性，b) 腫瘤微環(huán)境，c) 腫瘤免疫反應，d) 腫瘤進化，e) 細胞受體，配體間相互作用，f) 腫瘤耐藥性，g) 腫瘤干細胞分化；
4. 干細胞發(fā)育及分化研究；
5. 免疫研究：a) 構建免疫圖譜，b) 免疫細胞分化，c) 免疫治療；
6. 生物標志物挖掘
3、案例分析
案例 1：利用空間組學技術解析人結直腸癌中的多細胞免疫中心
研究背景：
在結直腸癌中，錯配修復缺陷型(MMRd)腫瘤比錯配修復完整型(MMRp)腫瘤表現(xiàn)出更強的抗腫瘤免疫能力。為了了解不同反應的規(guī)律，作者采用單細胞和空間組學技術相結合的方法對此進行了解析。
研究思路：
作者從 28 個 MMRp 和 34 個 MMRd 個體的大腸腫瘤和 36 個鄰近正常組織中轉錄分析了 371,223 個細胞。對 88 個細胞亞群及其 204 個相關基因表達程序的分析顯示，結直腸癌中存在廣泛的轉錄和空間重構。為了進一步發(fā)現(xiàn)相互作用的惡性細胞和免疫細胞的樞紐，作者確定了不同細胞類型的表達程序，這些程序在受影響個體的腫瘤中存在共同變化，并使用空間圖譜來定位協(xié)同程序。同時，在腫瘤-管腔界面發(fā)現(xiàn)了一個與組織損傷相關的髓系細胞吸引中心，以及腫瘤內 MMRd 富集的免疫中心，這個免疫中心包含了活化的 T 細胞以及表達了趨化因子的惡性腫瘤細胞和髓樣細胞。
研究結果：
本研究提供了一個相對較大的腸癌患者數(shù)據(jù)集，進行了包括細胞狀態(tài)、基因程序及其在腫瘤中的轉化(如在間質細胞中觀察到的深刻變化)。作者基于基因程序的共同變異對幾個多細胞中心進行預測，隨后進行兩個免疫-惡性中心（hub 區(qū)域）的空間定位，將大量的細胞狀態(tài)和程序組成較少數(shù)量的細胞和過程的協(xié)調網絡。了解這些中樞的分子機制并研究它們在治療過程中的時間和空間調節(jié)對于推進癌癥治療至關重要。
Karin Pelka, et al. Spatially organized multicellular immune hubs in human colorectal cancer, Cell, Volume 184, Issue 18, 2021, Pages 4734-4752.e20,https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.08.003.
影響因子：41.582
案例 2：DSP 聯(lián)合單細胞解析滑膜肉瘤腫瘤免疫微環(huán)境
研究背景：
滑膜肉瘤是一種由 SS18-SSX 基因融合驅動的惡性腫瘤。該腫瘤的一個特點是腫瘤免疫微環(huán)境中極低的 T 細胞浸潤程度，因此目前在腫瘤治療領域大展身手的免疫療法在此處也不免折戟。基于滑膜肉瘤的含堿性組織特性，目前關于滑膜肉瘤的基因組學和分子致病機理研究依然依賴于少部分樣本的大塊組織進行分析，因此醫(yī)學界對于其中腫瘤異質性和免疫微環(huán)境的了解少之又少。如何通過深入了解滑膜肉瘤中腫瘤細胞群落和免疫細胞貧乏的原因對于將來在該疾病中讓更多病人收益于免疫療法有著深遠的意義。
研究思路：
1. 單細胞測序對 12 個滑膜肉瘤的 16,872 個細胞進行了分析并提取了腫瘤細胞富集的核心驅動基因標記，可區(qū)分上皮和間質細胞（mRNA/CNV/關鍵融合基因檢測SS18-SSX1/SS18-SSX2）
2. 原位免疫熒光檢測驗證核心驅動基因 KM 生存分析（HSP90、c-Jun、EGR1、LGALS1、E-cad、Vimentin）
3. 通過 DSP 技術，對 9 例患者 FFPE 樣本中的腫瘤細胞和免疫細胞進行空間轉錄組的分析（CTA），2 例開展 WTA 分析，形態(tài)學試劑為 CD45、panCK 及核染；
研究結果：
核心驅動基因 signature 主要集中在 TNF 信號通路、p53 信號通路以及細胞凋亡的抑制，說明該基因集在免疫抑制和腫瘤細胞增殖方面可能有著重要作用。應用核心基因集對大樣本量滑膜肉瘤病人進行生存分析驗證，發(fā)現(xiàn)該標記主要集中于分化更差、遠端轉移以及出現(xiàn)復發(fā)的病人當中，這一發(fā)現(xiàn)對于指導病人預后具有極大的臨床意義。NanoString 的 GeoMx Digital Spatial Profiler 平臺分析結果表明，核心驅動基因標記在組織空間中的分布與免疫細胞的浸潤呈現(xiàn)出負相關的關系，腫瘤細胞中的核心驅動基因標記越是富集，周圍的免疫細胞浸潤越低，說明該核心驅動基因直接抑制了 T 細胞的浸潤，令本來具有抗腫瘤活性的 CD8 T 細胞無法消滅這些腫瘤細胞。
Jerby-Arnon L, et al. Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma. Nat Med. 2021 Feb;27(2):289-300. doi:10.1038/s41591-020-01212-6. Epub 2021 Jan 25. PMID: 33495604.
影響因子：28.547
4、常見問題
Q1.通常樣品 nGene 和 nUMI 的相關性系數(shù)要在 0.8 以上，但是這次實驗的相關性在 0.5以下，怎么解釋這個情況，得到的實驗下機數(shù)據(jù)還可靠嗎？
影響相關性的因素有文庫制備過程的穩(wěn)定性和細胞狀態(tài)的一致性。如果相關性較低，可能是由于文庫中細胞狀態(tài)差異較大。可能與細胞檢測時的狀態(tài)有關，有些細胞可能活性降低，核酸存在降解的狀態(tài)。
Q2. 檢測線粒體表達量目的是為了作為陰性對照嗎？正常線粒體基因在細胞中含量不是很多，那檢測線粒體表達量是評價測序結果好壞的一個陰性對照嗎？
檢測線粒體基因的表達量是一個數(shù)據(jù)分析質控指標。除了部分特殊類型的細胞（如卵細胞），如果定位到線粒體的比例高，表明細胞質量較低，這可能是細胞凋亡增加所致。
高通量測序
NGS
1、平臺介紹
DNBSEQ-T7 基因測序儀、MGISEQ-2000 基因測序儀等儀器所采用的專有 MGI 技術通過升級流動槽，流體、生化和光學系統(tǒng)，基于 DNBSEQTM 技術，4 聯(lián)芯片平臺，支持PE150 和 PE100 不同讀長并行測序，全面升級生化、流體及光學系統(tǒng)，使測序更加高效多產。帶來了更高的準確度，并提高了效率。日產出高質量數(shù)據(jù) 1-6 T，廣泛適用于全基因組測序、超深度外顯子組測序、表觀基因組測序、轉錄組測序和腫瘤 Panel 等大型測序項目。
2、服務優(yōu)勢
1. 經驗豐富的技術人員：擁有經驗豐富的實驗人員和自主可控的實驗平臺。
2. 強大的實驗平臺：擁有國際領先的 DNBSEQ-T7、MGI2000 等高通量測序儀器 ，高效、穩(wěn)定。
3. 個性化的信息分析：對于非標準信息分析要求，可根據(jù)客戶需求制定個性化信息分析方案，信息分析專人跟進，確保滿足客戶需求。核酸蛋白質緊密結合：依托于一流的檢測平臺，將核酸、蛋白質緊密結合，提供一站式完整服務，為生命學研究提供有力支持。
3、產品簡介
4、常見問題
Q1. 人基因組部分區(qū)域 GC 含量過高對重測序有什么影響？
由于化學本質的問題，GC 含量高、擴增困難、偏差大，從而引起測序偏差。因此，一般高 GC 區(qū)域的平均深度較整個基因組的平均深度要低。另一方面，高 GC 也影響酶擴增時的準確性，即高 GC 可能提高擴增時的錯誤率，短讀長測序本身也是一種合成/擴增，因此也會提高錯誤率，導致整條序列的錯誤率提高，錯誤率越高，reads 比對時就有可能比對到錯誤的位置，或者比對不上。
Q2. 測序深度的意義是什么？
測序深度是指測序得到的堿基總量占基因組小大的比值，測序深度越高，測序結果越準確，后續(xù)的統(tǒng)計分析也就越準確。如果做腫瘤、低頻突變的研究，建議測序深度至少達到200X 以上。如果只看經典 SNP、非低頻突變，測序深度至少也應該在 50X 以上。
Q3. 轉錄組高通量測序有什么優(yōu)勢？
轉錄組是直接對樣本 mRNA 進行測序，能夠發(fā)現(xiàn)很多新的 mRNA，轉錄組測序對基因表達上調或下降的檢測范圍可以達到幾萬倍，而且在有參考基因組的情況下，通過轉錄組測序還可以分析可變剪接、基因結構變異、全基因組水平基因表達豐度等情況。
Q4. 什么是長鏈非編碼 RNA？他們的作用是什么？
哺乳動物基因組序列的約 5%-10%被穩(wěn)定轉錄，蛋白質編碼基因僅約占 1%，其余 4%-9%的序列都轉錄為非編碼 RNA。而非編碼 RNA（non-coding RNA）是指不能翻譯成蛋白質的功能性 RNA 分子。長鏈非編碼 RNA 為這 4%-9%中長度大于 200nt 的非編碼 RNA。他們的作用主要體現(xiàn)在 4 個方面，①影響周邊基因的表達；②調控蛋白質活動和定位；③產生小分子 RNA；④對其他 RNA 的調控作用。
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