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前言

Bintrafusp alfa是一種可以靶向PD-L1和TGFβRⅡ的雙功能抗體蛋白，Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗發現其在人類乳頭瘤病毒 (HPV) 相關腫瘤中具有臨床活性。美國國家癌癥研究所腫瘤免疫與生物醫學實驗室Jeffrey Schlom博士團隊從不同的層面，在bintrafusp alfa治療前和治療早期探索HPV相關腫瘤患者的外周免疫特征，以更好地了解藥物作用方式并幫助鑒別能從bintrafusp alfa治療中獲益的人群。本文利用Olink技術實時監測外周可溶性因子/細胞因子的狀態及變化趨勢，發現基線細胞因子狀態與人群特征有顯著相關性，且Bintrafusp alfa可以改變患者的細胞因子水平，這種改變與bintrafusp alfa治療反應相關。研究成果于2022年3月發表在Journal for ImmunoTherapy of Cancer (IF:13.8 )上，文章標題為 “Immune correlates of clinical parameters in patients with HPV-associated malignancies treated with bintrafusp alfa”。

研究方法

研究對象：

入組65例HPV相關的惡性腫瘤，其中43例既往未接受過免疫治療 (ICI na?ve)，22例接受免疫治療后進展 (ICI難治性)，包括宮頸癌（n=28）、頭頸鱗癌（H&N，n=18）、肛門癌（n=10）和HPV相關罕見腫瘤（n=19）；

檢測樣本：血液；

采樣時間：基線，治療后2周 (1個周期)，治療后6周 (3個周期)；

檢測內容及方法：

中性粒細胞/淋巴細胞比例（NLR）

全血細胞計數 (CBC):

血漿細胞因子/可溶性因子分析 (n=64)：

ELISA

Olink Target 96 Immuno-Oncology panel

158種外周血免疫細胞分型 (n=31)：

多色流式細胞

TCR分析(n=12)：

TCR Vβ CDR3 sequencing

抗原特異性T細胞分析 (n=44)：

體外HPV-16、HPV-18和MUC-1多肽刺激細胞實驗

研究結果

HPV相關腫瘤患者的基線外周免疫組分特征

不同癌種之間的免疫特征差異

各癌種基線免疫特征差異不大，所以本研究中將不同的HPV相關腫瘤作為一個整體進行分析。作者利用Olink IO panel進一步分析了基線ICI na?ve 與難治性患者的差異，發現難治性患者中有9個細胞因子表達升高（PDCD1、PDL1、FGF2、CXCL9、CXCL10、CCL20、NOS3、MMP12 和 MUC16）；無監督聚類分析顯示這9個細胞因子可以區分ICI na?ve和難治性患者。

圖1. ICI na?ve與ICI 難治性HPV相關腫瘤患者中基于Olink的外周細胞因子差異分析

Bintrafusp alfa與外周免疫特征的關系

1、基線免疫狀態與bintrafusp alfa治療反應相關

研究人員根據治療反應將患者分為兩組：最佳總臨床反應( BOR) 為 CR、PR、MR或至少4個月SD的患者作為反應組（R組）；BOR 為 PD的作為無反應組（NR組）。R組具有較低水平的抑制因子TGFβ1和可溶性CD73，以及較高的sCD27:sCD40L比值，這表明R組比NR組在治療前具有更高的免疫激活水平。使用 Olink Immuno-Oncology panel對 92 種血漿分析物進行評估，發現了12種蛋白在R組含量較低（CD40L、FGF2、HGF、IL-6、TGFβ1、TNFSF14、NOS3、CXCL1、CXCL5、IL-7、MUC16 和 PTN），無監督聚類分析發現大多數R組聚集在一起，與NR組分開。

圖2.  Bintrafusp alfa治療反應與血漿可溶性因子的相關性

基線處R組和NR組的免疫細胞亞群也有顯著差異，R組患者的 MDSCs和單核細胞水平較低，而CD8+T細胞:MDSCs的比率較高。治療前，R組與免疫激活相關的細胞含量較高，初始CD4+和CD8+T細胞以及免疫抑制相關的免疫細胞水平顯著降低。

在基線時，雖然只有少數患者的樣本可用，但觀察到有反應患者的外周血中TCR多樣性水平低于無反應患者的趨勢，83%的反應者（5/6）和33%的無反應者（2/6) T細胞庫的Top25%的TCR 克隆不到400個。

圖3. Bintrafusp alfa治療與基線外周免疫細胞的相關性

2、Bintrafusp alfa 治療可以影響患者的外周免疫特征

Bintrafusp alfa治療1個周期后，免疫抑制細胞因子TGFβ1顯著降低，且持續整個給藥周期；sPD-1、sCTLA4、sCD73、sCD27水平及sCD27：sCD40L比值升高，除sCD73外，3個周期后這些分析物仍持續高于基線水平。三個治療周期后，免疫抑制細胞因子IL-8增加。治療后CBC也發生變化：白細胞計數 (WBC)、ANC、NLR 和絕對單核細胞計數 (AMC) 在一個和三個周期的治療后均增加；CD8+T細胞 （1個周期后）、CD4+T細胞（3個周期后）和 NK-T細胞（1個和3個周期后）減少。 

3、Bintrafusp alfa誘導的早期免疫特征變化與治療臨床反應相關

Bintrafusp alfa治療一個周期后，與NR組相比，R組患者的IL-8降低、ALC升高、 ANC和 NLR降低。三個治療周期后，IL-8、ANC和NLR的差異持續存在。

圖4. Bintrafusp alfa治療后外周免疫特征早期變化

構建預測HPV相關癌癥患者對 bintrafusp alfa 反應的模型

1、利用治療前和治療后的外周免疫特征進行建模

研究人員接下來僅用血漿因子和CBC參數進行logistic回歸分析構建預測bintrafusp alfa治療反應的模型。有58名患者在基線和治療2周后的數據可用。這些患者按照上述標準分成R組和NR組，并將患者隨機分為訓練集 (n=43) 和測試集 (n=15)。由訓練集開發了一個3個因子（基線TGFβ1含量的log值、IL-8和NLR治療2周后的百分比變化）組成的模型，ROC 曲線分析顯示的全局 χ2為23.93，AUC為0.892。利用該模型計算患者治療獲益概率，以0.5為cutoff值，在訓練集中預測臨床反應的準確率為84%，在測試集中的準確率為80%，在訓練集和測試集的組合中準確率為83%。獲益概率>0.5的患者的中位總生存期（1222天）明顯長于反應概率≤0.5的患者的總生存期（142天，p=0.0004）。

圖5. 利用治療前和治療后的外周免疫特征進行logistic回歸分析建模

2、利用治療前的外周免疫特征進行建模

研究人員用基線數據開發了第二個預測模型，符合要求的患者為63例。將患者按照總生存期≧180天與<180天分成2組，并分為訓練集 (n=42) 和測試集 (n=21)。由訓練集開發了一個3因子（基線TGFβ1、IL-8和NLR含量的log值）組成的模型，ROC 曲線分析顯示全局 χ2為16.32，AUC為0.841。利用該模型計算患者治療獲益概率，以 0.5 為cutoff值，該模型預測≥180天的總生存期，訓練集中準確率為76%，測試集準確率為91%，測試集和訓練集的組合中準確率為81%。獲益概率>0.5的患者的中位總生存期（1061天）明顯長于≦0.5 的患者（109 天，p<0.0001）。

圖6. 利用治療前外周免疫特征進行logistic回歸分析建模

總結

本研究發現治療前免疫抑制組分含量低、免疫激活的患者更容易從bintrafusp alfa 治療中獲益。Bintrafusp alfa治療也會進一步影響患者外周免疫特征，與無反應者相比，臨床反應患者的IL-8、NLR增加較少。研究者基于外周免疫組分特征，構建了兩個篩選bintrafusp alfa 反應的模型，準確率大于80%。很多晚期腫瘤患者無法獲得腫瘤組織標本，難以進行基于組織的人群篩選和藥物機制研究。本文利用外周血，多點實時采樣，基于全血細胞計數、ELISA、Olink、TCR-seq等技術分析外周免疫細胞亞群和細胞因子等免疫組分特征，提供了一種可實時評估患者在治療前和/或治療后免疫狀態的方法和思路。